Atualizado: 14 de jul. de 2020
Oi biologuínhos, tudo bem? Final do semestre está chegando e com isso temos nossos últimos posts universitários! Dessa vez trouxe o último post de Biologia Molecular (matéria que ganhou meu coração, como o esperado), vamos lá?!
Hoje falaremos de isolamento de genes, processo composto por algumas etapas, sendo elas:
1- Obtenção de material para extrair o DNA Antes de realmente falarmos em DNA, precisamos pensar como teremos ele. Sabemos que o ácido desoxirribonucleico está presente em todas as células do organismo, sendo assim, temos várias possibilidades de obtenção do mesmo, já que as células são as unidades básicas de vida. Dentre as formas mais comuns de se obter o DNA, temos via células isoladas, células de mucosas (como da boca, por exemplo), tecidos derivados de biópsias (lembrando que tecidos são formados por células!), tecidos mumificados, tecidos secos, tecidos fixados e ossos.
O isolamento não é realizado somente com a extração de DNA, mas também com o RNA. Porém, o ácido ribonucleico é menos estável que o ácido desoxirribonucleico, logo deve ser obtido a partir de tecidos frescos ou conservados.
2- Extração do DNA da célula obtida A extração do DNA depende de fatores como quantidade, pureza, integridade, localização celular, origem, características particulares e aplicação final da molécula de será extraída. Sabemos que o DNA não está contido somente no núcleo (no caso de eucariotos), mas também na mitocôndria, cloroplasto (em células vegetais) ou plasmídeos (no caso de bactérias), logo pode ser extraído o DNA dessas partes.
Devemos relembrar conceitos de citologia: toda célula apresenta uma membrana, logo para que o DNA saia da mesma é necessária a ruptura dessa membrana. Isso pode ser feito via enzima, homogenização, solução, detergente (no caso da extração caseira!) ou sonificação (ondas sonoras).
Em seguida, há a desnaturação de proteínas (entende-se enzimas também!): esse processo pode ser realizado por temperatura, inibidores, reagentes (no caso de DNA: fenol/cloroformio/álcool isoamílico / RNA: β-mercaptoetanol isotiocianato) e compostos (como citrato e EDTA).
Posteriormente, é necessário que haja a separação do DNA, que já se encontra fora da célula (na solução), e das macromoléculas que estão presentes na mesma. Para isso, são utilizados alguns métodos como centrifugação em cloreto de césio, solvente (fenol é o mais utilizado!) ou precipitação (DNA e RNA: etanol / RNA ribossômico e mensageiro: cloreto de lítio).
3- Digestão do DNA em fragmentos Agora chegamos no momento de isolamento gênico: para ser isolado com maior facilidade, o DNA é fragmentado por enzimas de restrição (também conhecidas como endonucleases) que identificam o local a ser fragmentado e apresentam um sítio de clivagem.
4- Amplificação do DNA É necessário que o DNA seja amplificado, isto é, copiado várias vezes, para melhor visualização. Essa amplificação pode ser realizada in vivo ou in vitro. In vivo basicamente podemos definir que é utilizada uma célula hospedeira, que geralmente é procariota graças à sua rápida reprodução e fácil cultivo. In vitro podemos definir com uma simples palavra que representa um processo incrível: PCR (que veremos adiante).
Pode ser via plasmídeos (que podem estar presentes em grandes quantidades na célula e contém sítios de restrições estratégicos), bacteriófago (permite transportar genes (=sequências) maiores de DNA), cosmídeos (produzido em laboratório, são a união entre plasmídeos e fagos, permitindo uma seleção maior e o transporte de genes maiores), YAC (também produzido em laboratório, porém a partir de leveduras, apresenta telômero, centrômero e sequência autônoma de replicação- consegue se replicar independentemente) e BAC (produzido em laboratório, a partir de bactérias, é linear, apresenta telômero, centrômero e sequência autônoma de replicação).
Mas e o PCR? A Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) realiza uma amplificação do DNA em milhares de cópias, em uma hora (geralmente são realizados 30 ciclos e cada um dura 2 minutos), tendo como vantagem a agilidade do processo, adaptação (cada fragmento recebe um protocolo), aparelhagem automática para realização do processo e necessita de pouco DNA para ser copiado. É uma técnica muito utilizada para análise de polimorfismos, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, estudos de evolução molecular e medicina forense.
O procedimento é descritivamente simples: inicia-se com a reunião de compostos em um tubo de ensaio, sendo eles o próprio fragmento de DNA que foi extraído e isolado, a enzima Taq-polimerase (uma DNAse de arqueobactéria), nucleotídeos trifosfato e primers, tudo em solução salina tamponada. Após isso, com o material em um aparelho denominado termociclador, eleva-se até a temperatura de 90-95ºC para que ocorra a separação das fitas de DNA, da dupla-hélice. Em seguida, a temperatura resfria-se até 55ºC, promovendo a ligação dos primers às fitas de DNA. Por fim, a Taq-polimerase insere nucleotídeos, produzindo as cópias. Esse procedimento, também chamado de ciclo, é repetido cerca de 30 vezes, resultando em um número considerável de cópias.
ELETROFORESE A técnica de eletroforese faz com que a visualização do fragmento de DNA seja possível através da aplicação de um campo elétrico, e assim sua comparação. É muito utilizado em exames de paternidade e medicina forense.
Descritivamente também é muito simples: é preparado um gel de agarose que é submetido a um pente que forma pentes, onde é depositado o DNA e o corante fluorescente brometo de etídeo. De um lado da placa é colocado o catodo e do outro, o anodo, promovendo a carga que separará a molécula para a visualização.
Referência: Aulas da Professora de Biologia Molecular da Universidade de Taubaté (UNITAU): Marisa Cardoso;